基因甲基化

甲基化的概念

释义

甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物 的过程。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。 在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白 质功能的调节以及核糖核酸(RNA)加工。

类型

甲基化包括DNA 甲基化或蛋白质甲基化

（1）DNA 甲基化。脊椎动物的DNA 甲基化一般发生在CpG 位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌 呤位点，即DNA 序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点）。经DNA 甲基转移酶催化胞嘧啶转 化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80%-90%的CpG 位点已被甲基化，但是在某些特定区 域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG 岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56% 的哺乳动物基因中的启动子有关。1%-2%的人类基因组是CpG 群，并且CpG 甲基化与转 录活性成反比。

（2）蛋白质甲基化。蛋白质甲基化一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。 精氨酸可以被甲基化一次（称为一甲基精氨酸）或两次（精氨酸甲基转移酶（PRMTs）将 两个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同一个氮原子上成为非对称性甲基精氨酸，或者在每 个氮端各加一个甲基成为对称性二甲基精氨酸）赖氨酸经赖氨酸转移酶的催化可以甲基化一 次、两次或三次。在组蛋白中，蛋白质甲基化是被研究最多的一类。在组蛋白转移酶的催化 下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到组蛋白。某些组蛋白残基通过甲基化可以抑制或激活基因 表达，从而形成为表观遗传。蛋白质甲基化是翻译后修饰的一种形式。

功能

甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、 老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。最常见的甲基化修饰有 DNA 甲基化和组蛋白甲基化。

DNA 甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA 甲基化能引起染色质结构、DNA 构象、DNA 稳定性及DNA 与蛋白质相互作用方式的改变， 从而控制基因表达。研究证实，CpG 二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3 以上由于 碱基转换而引起的遗传病。DNA 甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基 腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在 CpG 序列、CpXpG、CCA/TGG 和GATC 中。

DNA 甲基化是指生物体在DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下， 以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA 甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6 位、鸟嘌呤的N-7 位、胞嘧啶的C-5 位等。但在哺乳动物中DNA 甲 基化主要发生在5’-CpG-3’的C 上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。

在哺乳动物中CpG 以两种形式存在：一种是分散于DNA 序列中；另一种呈现高度聚 集状态，人们称之为CpG 岛（CpG island）。在正常组织里，70%～90%散在的CpG 是 被甲基修饰的，而CpG 岛则往往是非甲基化的（除有些特殊区段和基因外）。正常情况下，人类基因组“垃圾”序列的CpG 二核苷酸相对稀少，并且总是处于甲基化状态，与之相反，人类基因组中大小为100-1000bp 左右，富含CpG 二核苷酸的CpG 岛则总是处于未甲基化 状态，并且CpG 岛常位于转录调控区附近，与56%的人类基因组编码基因相关，因此基因 转录区CpG 岛的甲基化状态的研究就显得十分重要。人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组CpG 岛约为28890 个，大部分染色体每1Mb 就有5-15 个CpG 岛，平均值为 每Mb 含10.5 个CpG 岛，CpG 岛的数目与基因密度有良好的对应关系。

DNA 甲基化主要是通过DNA 甲基转移酶家族来催化完成的。研究人员在真核生物中 发现了3 类DNA 甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b).Dnmt1 一种是维持性甲 基化酶;Dnmt2 可与DNA 上特异位点结合，但具体作用尚不清楚;Dnmt3a 和Dnmt3b 是重 新甲基化酶，它们使去甲基化的CpG 位点重新甲基化，即参与DNA 的从头甲基化。在哺 乳动物的生殖细胞发育时期和植入前胚胎期，其基因组范围内的甲基化模式通过大规模的去 甲基化和接下来的再甲基化过程发生重编程，从而产生具有发育潜能的细胞；在细胞分化的 过程中，基因的甲基化状态将遗传给后代细胞。由于DNA 甲基化与人类发育和肿瘤疾病的 密切关系，特别是CpG 岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题，DNA 甲基化已经成为表观遗 传学和表观基因组学的重要研究内容。

组蛋白甲基化是指发生在H3 和H4 组蛋白N 端Arg 或Lys 残基上的甲基化，由组蛋 白甲基转移酶介导催化。组蛋白甲基化的功能主要体现在异染色质形成、基因印记、X 染色 体失活和转录调控方面。除了存在组蛋白甲基转移酶以外，还发现了去甲基化酶。先前人们 认为组蛋白的甲基化作用是稳定而不可逆的，使这种去甲基化酶的发现使组蛋白甲基化过程 更具动态性。

检测方法

(1) 甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基 化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP 扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA 链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲 基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

(2)亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化 的胞嘧啶不变。随后设计BSP 引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶， 最后对PCR 产物进行测序就可以判断CpG 位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。 将PCR 产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序 法。

(3) 高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）

在非CpG 岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA 双链的引物，这对引物中间 的片段包含感兴趣的CpG 岛。若这些CpG 岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲 基化的胞嘧啶经PCR 扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC 含量 发生改变，从而导致熔解温度的变化。

(4) 基因组直接测序法

基因组直接测序法是过去一直沿用的DNA 甲基化的研究方法，用Maxam—Gilbert 化 学裂解法对基因组DNA 进行处理，并以连接介导的PCR 来放大信号强度，然后进行序列 分析。此法是基于5mC 在标准的Maxam—Gilbert 胞嘧啶化学裂解反应中不被裂解，故5mC 可通过在测序胶上缺少对应于胞嘧啶降解反应产物的一个条带而得以鉴定。如采用MnO4 - 哌 啶法，结果则反之因此在检测5mC 时，此两法可提供完全互补的检测信息。该法与LM—PCR 结合后，大大降低了对基因组DNA 的需要量(1～2 ng)。当5mC 和C 同时处于不同DNA 分子上的同一位点时，该位点至少要有25%的5mC 才能被N2H4法检测到；MnO4 -法比N2 H4 法更灵敏。因为这两种基因组DNA 化学修饰法均有抑制DNA 聚合酶延伸的特性，无须进 行DNA 哌啶裂解就可通过基因组直接测序技术进行甲基化分析。