乳杆菌酵母菌及混菌对发酵饲料品质的影响

近年来，利用微生物发酵技术来开发新型饲料资源越来越受到人们的重视。通过微生物发酵，可使饲料或者饲用原料中含有更多的活性益生菌菌体、各种消化酶及代谢产物、蛋白质分解产物及活性小肽、抑菌物质，同时使饲料中的抗营养因子含量降低，起到促进生长、维持动物健康的作用。常用的微生物发酵菌种主要是乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌和霉菌。乳酸菌发酵饲料可以降低仔猪胃内的酸度，增加仔猪的采食量，从而提高其生产性能，同时，能有效抑制有害细菌的生长和繁殖，控制仔猪的腹泻，减少抗生素的使用，具有良好的生产和应用价值；酵母菌富含蛋白质、氨基酸(粗蛋白质含量高达5O%)及多种维生素，同时含有多种动物所需的消化酶(α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶等)和其他代谢产物，在提高动物的免疫、生长和繁殖能力方面具有显著功效，是天然绿色生物饲料添加剂，价格低廉并有很高的经济价值，市场需求旺盛，具有很好的应用前景；酸溶蛋白即分子质量较低的蛋白水解物，包括肽和游离氨基酸，使用酸溶蛋白含量指标评价发酵酶解粕类蛋白质品质，既可以反映其中抗原蛋白质和其他蛋白质抗营养因子被水解的程度，进而揭示该类抗营养因子活性被消除的程度，又可一定程度上反映肽含量的高低，表明畜禽生长必需氨基酸含量增加，发酵饲料中氨基酸组成在向优质化方向转化。

目前，国内外对微生物发酵饲料在畜禽饲养中的应用和理论研究较多。但国内外对发酵饲料的研究主要集中在发酵菌株类型、生理功能、饲喂效果上，对影响发酵饲料品质的发酵方式、生产工艺条件、发酵众多代谢物质的活性成分分析等研究相对较少，对发酵饲料众多代谢产物的有效成分缺乏较深入的研究。本试验旨在研究适宜哺乳母猪全价饲料发酵的乳杆菌和酵母菌的筛选和复配发酵方式对发酵饲料pH、活菌数、总酸含量、粗蛋白和酸溶蛋白含量的影响，为乳杆菌和酵母菌发酵全价饲料提供理论依据。

1.1 材料与试剂

1.1.1 发酵基料和菌株

玉米豆粕型配合饲料。

6株乳杆菌菌株(BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0038、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0114；4株酵母菌菌株(BLCC4-0048、BLCC4-0021、BLCC4-0044、BLCC4-0042)。

1.1.2 培养基

MRS培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4g/L，硫酸镁0.5gm，硫酸锰0.3g/L，柠檬酸铵2g/L，乙酸钠5gm，吐温-80 1 mL/L，pH值6.0，121 ℃灭菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YEPD)培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏0.5g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，pH自然，121 ℃灭菌20min。

1.1.3 化学试剂

葡萄糖；蛋白胨；牛肉膏、酵母膏；硫酸镁、硫酸锰；柠檬酸铵；乙酸钠；吐温-80、氢氧化钠；磷酸二氢钾；氯化钠；LBS琼脂培养基、孟加拉红培养基。所用实验试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DHP-9082电热恒温培养箱；THZ-C恒温振荡器；HH-4数显恒温水浴锅；KDN-103F自动定氮仪、HYP-1008)八孔消化炉。

1.3 试验方法

1.3.1 酵母菌和乳杆菌发酵液的制备

将4℃条件下保存的酵母斜面活化，转接到装有50 mL YEPD培养基的三角瓶中，30℃摇床振荡培养16 h备用：将4℃条件下保存的乳杆菌斜面活化，转接到装有100 mL MRS培养基的盐水瓶中，37℃培养箱静置培养24 h备用。

1.3.2 试验设计

(1)乳杆菌的筛选

称取一定量的基料按料水比1：0.4(g：mL)，以装袋量为100 g/袋装袋，每个样品设3个平行，分别按照2％接种量接入培养好的乳杆菌发酵液，以不接种任何菌株的空白料为对照，压实后于37℃培养箱进行生料厌氧发酵，分别于发酵24 h、48 h和72 h取样，测定pH值、活菌数和总酸含量。

(2)酵母菌的筛选

称取～定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比为1：0.4(g：mL)，装量50 瓶，按2％接种量分别接入培养好的酵母菌种子液，每个样品设3个平行，以不接种任何菌株的空白料为对照，置于30℃培养箱进行需氧发酵，分别于发酵24 h、48 h和72 h取样，测定活菌数和粗蛋白含量。

(3)混菌发酵

将上述筛选得到的乳杆菌和酵母菌进行混菌发酵，发酵方式为厌氧发酵，料水比为1：0.4(g：mL)，以装袋量为100g/袋 装袋，接种量2％，乳杆菌：酵母菌(3：2)，生料发酵，30℃培养箱培养。以不接种任何菌株的空白料为对照，分别于发酵24 h、48 h和72 h取样，测定pH值、活菌数、总酸、粗蛋白和酸溶蛋白含量。

1.3.3 测定方法

pH测定：取10 g样品加入90 mL灭菌后的生理盐水中，搅拌均匀后直接测定。

乳杆菌和酵母菌活菌数的测定：准确称取发酵饲料10.0 g，用生理盐水10倍递增稀释，取适当稀释度的样品分别至LBS培养基和孟加拉红培养基中，分别于37℃和30℃培养48 h，根据菌落数计算样品中乳杆菌和酵母菌数量，结果用CFU/g表示。

总酸含量的测定：参照国标GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法测定。

粗蛋白含量：参照国标GB/T 6432-1994《饲料中粗蛋白测定方法》测定。

酸溶蛋白含量：参照QB/T 2653-2004《大豆肽粉》中酸溶蛋白质含量的测定。准确称取样品2.00 g，加入15％三氯乙酸溶液25 mL，混合均匀，静置30 min。将溶液定量转移，在4 000 r/min条件下离心10 min后，取全部上清液，以下按照上述粗蛋白的测定方法。结果为占粗蛋白的百分含量。

2.1 乳杆菌发酵对饲料品质的影响

乳杆菌发酵对饲料品质的影响见表1。由表1可知，发酵24 h时除菌株BLCC2-0038发酵pH较高外，其余均在5以下，均显著低于对照组(P<0.05)，其中以菌株BLCC2-0015最低；48 h和72 h时， 各pH值均有所下降， 以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092较低，菌株BLCC2-0015在发酵48 h时pH值达到最低，仅为4.12。各菌株发酵活菌数均在10⁹CFU/g水平， 各取样时问点时均以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092活菌数较高，其中菌株BLCC2-0092发酵48 h活菌数达到8.1×10⁹CFU/g。各菌株发酵料总酸含量均逐渐升高， 以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092的总酸含量一直处于较高水平，均显著高于其他组(P<0.05)。其中以菌株BLCC2-0015发酵72 h时最高，为24.84 mg/g。

综合考虑，选择适宜哺乳母猪全价料发酵的乳杆菌为菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092。

2.2 酵母菌发酵对饲料品质的影响

酵母菌发酵对饲料品质的影响见表2。由表2可知，菌株BLCC4-0048在发酵24 h、48 h和72 h时活菌数均在10⁸CFU/g水平，其余菌株均在10⁹CFU/g水平。24 h以菌株BLCC4-0021发酵活菌数最高，其次是菌株BLCC4-0042；48 h和72 h时均以菌株BLCC4-0021发酵活菌数最高，72 h时为53.5x10⁸CFU/g；其次是菌株BLCC4-0042，两者间差异不显著(P>0.05)。由粗蛋白含量来看，各菌株间差异均不显著(P>0.05)，其中以菌株BLCC4-0021和菌株BLCC4-0042发酵时稍高。

综合考虑，选择适宜作为发酵哺乳母猪全价饲料的酵母菌为BLCC4-0021和BLCC4-0042。

2.3 混菌发酵对饲料品质的影响

利用筛选得到的乳杆菌BLCC2-0015、BLCC2-0092和酵母菌BLCC4-0021、BLCC4-0042混菌发酵哺乳母猪全价饲料，发酵方式为厌氧发酵(乳杆菌/酵母菌为3：2，接种量2％)，发酵温度为32℃。以不接种任何菌株的空白料为对照，考察混菌发酵对饲料品质的影响，结果见表3。

由表3可知，R0015+J0021、R0015+J0042发酵各时间点的pH值均显著低于R0092+J0021、R0092+J0042厌氧联合发酵(P<0.05)。各复配组在各时间点的乳杆菌活菌数均在10⁹CFU/g水平，且R0015复配发酵时乳酸杆菌活菌数较高；24 h时R0015+J0021和R0015+J0042发酵活菌数显著高于R0092+J0021和R0092+J0042复配发酵时(P<0.05)。且随发酵时间的延长，活菌数呈下降趋势，发酵72 h时酵母菌活菌数低于接种量。R0015+J0021和R0015+J0042发酵组粗蛋白含量均高于R0092+J0021和R0092+J0042复配发酵组，其中24 h和48 h时差异显著(P<0.05)。酸溶蛋白含量和总酸含量结果一致，R0015+J0021和R0015+J0042复配发酵组均显著高于R0092+J0021和R0092+J0042复配发酵组(P<0.05)；R0015+J0021最高。

综合考虑，选择乳杆菌BLCC2-0015与酵母菌BLCC4-0021(3：2)联合发酵哺乳母猪全价料效果最优。发酵24 h时，乳杆菌活菌数可达67.0x 10⁸CFU/g，粗蛋白含量高出对照组45.41％，酸溶蛋白含量高出对照组23.41％，总酸含量可达到20.68 mg/g。

本试验对菌种库保存的性能优良的乳酸杆菌和酵母菌发酵哺乳母猪全价料饲料，根据发酵后饲料pH值、活菌数、粗蛋白、酸溶蛋白和总酸等指标，筛选出适宜发酵的乳杆菌为BLCC2-0015和BLCC2-0092，适宜发酵的酵母菌为BLCC4-0021和BLCC4-0042。混菌发酵时，以BLCC2-0015+BLCC4-0021(3：2)复配组效果最优，发酵24 h时，乳杆菌活菌数可达67.0x10⁸CFU/g，粗蛋白含量高出对照组45.41％，酸溶蛋白含量高出对照组23.41％，总酸含量可达20.68 mg /g。